Evaluación clínica de biomarcadores expresados en células mononucleares de sangre periférica: aplicación diagnóstica en pacientes con riesgo de desarrollo de ateroesclerosis.

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) ocupan el primer lugar mundial en cuanto a morbilidad y mortalidad, con un estimado de 17,5 millones de muertes en 2014, lo que representa el 31% de todas las muertes. La causa principal de ECV, es la ateroesclerosis, la cual se define como un proceso inflamatorio crónico de la pared arterial, originado por disfunción endotelial que conlleva a la acumulación subendotelial, mediada por una marcada dislipemia, de lipoproteínas de baja densidad (LDL), que se vuelven susceptibles a modificaciones oxidativas o enzimáticas, convirtiéndose en lipoproteínas modificadas que no pueden ser reconocidas por su receptor natural (LDL-R). Esta acumulación anómala de LDL modificadas origina que células endoteliales (CE), expresen diversas moléculas de adhesión (I-CAM y V-CAM), que facilitan el reclutamiento y adhesión de leucocitos circulantes. Se desencadena así, una marcada secreción de quimiocinas que promueven la infiltración y proliferación celular a nivel de la íntima arterial de monocitos, linfocitos T, neutrófilos y células musculares lisas (CML). En particular, los monocitos circulantes reconocen las moléculas de adhesión expresadas en las CE iniciando de manera temprana los procesos de adhesión y diapédesis a nivel endotelial, para luego transformarse en macrófagos en el espacio subendotelial, capaces de internalizar lipoproteínas modificadas por endocitosis mediada por receptores del tipo LRP-1 (por low density lipoprotein receptor-related protein 1) y receptores scavenger, como CD36 (del inglés, Cluster of Differentiation, también conocido como Platelet Glycoprotein 4) y MSR-1 (del inglés, Macrophage Scavenger Receptor), entre otros. De esta manera, la captación mediante éstos receptores induce la transformación de los monocitos-macrófagos en Foam Cells (FC) que componen la llamada estría grasa, primera manifestación del proceso ateroesclerótico. Los macrófagos activados liberan enzimas lisosomales y especies reactivas que inducen muerte celular y degradación de la matriz extracelular, además de otras citocinas proinflamatorias. En este microambiente subendotelial, se ha constatado previamente que LRP-1 desempeña varias funciones protectoras contra el desarrollo y progresión de la ateroesclerosis. Los mediadores inflamatorios producen disminución de LRP-1 en macrófagos. Por otro lado, LRP-1 es capaz de regular negativamente la vía inflamatoria NF-kB, limitando la expresión de citocinas proinflamatorias como CCL2 y el reclutamiento celular a la placa. Además, controla la actividad de metaloproteasas, lo cual lo transforma en un regulador de la integridad vascular y el destino de la placa. Asimismo, en etapas avanzadas de la aterosclerosis, se ha demostrado que LRP-1 está altamente expresado en CML y macrófagos,donde media la captación e internalización de LDL agregadas, llevando a la acumulación de ésteres de colesterol y formación de FC, un acontecimiento clave en el inicio y la progresión de la placa. En la práctica clínica, los algoritmos de predicción de riesgo, se han utilizado para identificar individuos con alto riesgo de desarrollar ECV a corto plazo, sin embargo, presentan limitaciones y no indican que el paciente haya iniciado o tenga enfermedad ateroesclerótica al momento de su evaluación clínica. Una opción para mejorar la certeza de riesgo, es incorporar nuevos biomarcadores y/o métodos de predicción/diagnóstico que identifiquen de manera subclínica la aparición de lesiones ateroescleróticas. De acuerdo a los antecedentes mencionados, como primera hipótesis se propuso que el nivel de expresión de LRP-1 y de receptores scavengers (CD36 y MSR-1) a nivel de la superficie celular del monocito, así como en subpoblaciones monocíticas, resultarían clave en el proceso de adhesión-migración del monocito a nivel de la pared endotelial así como en la expresión de factores proinflamatorios (TNF-a, IL-1b, CCL2, CCR2) durante la etapa temprana de la ateroesclerosis. En este sentido, y como una segunda hipótesis, se plantea que una eventual disminución en la expresión de LRP-1, conjuntamente con un aumento de receptores scavengers y factores proinflamatorios en monocitos servirían desde un punto clínico y diagnóstico como biomarcadores tempranos de la aterosclerosis. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue “Estudiar potenciales biomarcadores de desarrollo de ateroesclerosis desde un enfoque inflamatorio de la enfermedad” abordando los siguientes objetivos específicos: “i) Cuantificar el nivel de expresión de LRP-1, receptores scavengers (CD36 y MSR-1) y factores proinflamatorios en la población total de monocitos de sangre periférica; y ii) Medir la expresión diferencial de LRP-1 y receptores scavengers (CD36 y MSR-1) en subpoblaciones de monocitos”. Desde lo experimental, se desarrolló un estudio de investigación clínica, observacional prospectivo caso-control, realizado sobre una muestra poblacional de individuos con diferente estratificación de riesgo de ECV, sobre la cual se estudiaron potenciales biomarcadores (LRP- 1, CD36, MSR-1, CCL2, TNF-a, IL-1b y CCR2) abordado desde un enfoque inflamatorio de la ateroesclerosis. Para ello se estudiaron individuos clasificados como de “bajo riesgo” de desarrollo de ECV (n=21; 12 mujeres/9 hombres; edad promedio: 36,1±9,1 años) e individuos con “ateroesclerosis subclínica” (n=42; 17 mujeres/25 hombres; edad promedio: 50,4±8,3 años) determinados mediante parámetros clínicos, bioquímicos y de imágenes (Ecografía Doppler de carótida), analizándose los potenciales biomarcadores a nivel transcripcional (ARNm) y proteico en células mononucleares y monocitos de sangre periférica por ensayos qRT-PCR y de citometría de flujo (FACS), respectivamente. Los resultados obtenidos demostraron que los biomarcadores analizados son expresados mayoritariamente en monocitos circulantes con débil o no detectable expresión en otras poblaciones leucocitarias, principalmente linfocitos. Estos resultados permitieron definir que la expresión de los biomarcadores propuestos en células mononucleares de sangre periférica fueron representativos de la expresión en monocitos totales. A su vez, también se observó que los biomarcadores estudiados fueron mayoritariamente expresados en la subpoblación clásica de monocitos (CD14++/CD16-), que representa el 80% de los monocitos totales, respecto a lo medido en subpoblaciones intermedias (CD14++/CD16+) y no clásicas (CD14+/CD16++), con lo cual se estableció que las variaciones de los biomarcadores estudiados en monocitos totales reflejaron los cambios ocurridos a nivel de la subpoblación monocítica clásica. En ambos grupos de individuos estudiados se establecieron claras diferencias en los parámetros clínicos, antropométricos y bioquímicos que determinaron individuos de bajo y alto riesgo de ECV. No obstante, ambos grupos no mostraron diferencias estadísticamente significativas en el recuento de leucocitos, porcentaje de monocitos totales y distribución relativa de las subpoblaciones monocíticas. A nivel proteico se observó una marcada disminución de LRP-1 (p=0,0260), combinado con el aumento de CD36 y MSR-1 en la superficie celular de monocitos totales en individuos con ateroesclerosis subclínica respecto a lo observado en individuos con bajo riesgo. A nivel transcripcional se observó una expresión disminuida del ARNm específico para LRP-1 en células mononucleares de individuos con ateroesclerosis subclínica respecto a individuos con bajo riesgo (p=0,0002). En cuanto a CD36 (p=ns) y MSR-1 (p<0,0001) se obervó una expresión incrementada a nivel del ARNm en individuos con ateroesclerosis subclínica comparado con los de bajo riesgo. Cuando se analizaron los niveles de ARNm para los factores proinflamatorios (TNF-a, IL-1b, CCL2, CCR2) se observó una significativa activación proinflamatoria en células mononucleares circulantes de individuos con aterosclerosis subclínica respecto a los de bajo riesgo, con aumento en la expresión del ARNm específicos para IL-1b (p=0,0014) y TNF-a (p=0,0121) conjuntamente con un aumento en la expresión de la quimiocina CCL2 (p=0,0069) y su receptor CCR2 (p=0,0429). En conjunto, estos resultados demuestran que la disminución de LRP-1 combinado con aumentos en los niveles de receptores scavengers (CD36 y MSR-1) y factores proinflamatorios en células mononucleares y monocitos totales circulantes representarían nuevos biomarcadores de ateroesclerosis subclínica. En este sentido se propone que la medición de estos biomarcadores en asociación con el seguimiento clínico regular y realización de exámenes de diagnóstico por imágenes constituirían una sustancial mejora en la predicción de ocurrencia de eventos ateroescleróticos y enfermedad cardiovascular.