ARTICULO ORIGINAL Rev. Methodo 2021;6(4):155-161

https://doi.org/10.22529/me.2021.6(4)02

Recibido 04 Jun. 2021| Aceptado 08 Jul. 2021 | Publicado 05 Oct. 2021

Identificación y expresión del efector central fúngico Pep1 en

Thecaphora frezii

Identification and expression of the fungal central effector Pep1 in Thecaphora frezii

Néstor Walter Soria1

, Pablo Yang1

, María Soledad Díaz2

, Ana Cristina Figueroa2

, Valeria Roxana Alasino2,3

, Dante Miguel Beltramo1,2,3.

1 Universidad Católica de Córdoba, Facultad de Ciencias Químicas, Cátedra de Biotecnología, Unidad Asociada al CONICET: Área de Cs. Agrarias, Ingeniería, Cs. Biológicas.

2 Centro de Excelencia en Productos y Procesos de Córdoba – CEPROCOR

3 CONICET

Correspondencia: Néstor Walter Soria, e-mail: nestorwsoria@gmail.com Resumen

Thecaphora frezii es un hongo fitopatógeno perteneciente a la clase Ustilaginomicetes, que produce la enfermedad del carbón de maní. En su ciclo biológico presenta tres estructuras, las teliosporas (es la estructura de resistencia) y las basidiosporas e hifas. El micelio (hifas) es la estructura infectiva, que penetra en el ginóforo de la planta e inicia la infección. Para dicha acción, sería necesaria la expresión de la proteína Pep1 ya que la misma fue identificada en otros Ustilaginomicetes como el Ustilago maydis y el Ustilago hordei, que infectan al maíz y a la cebada, respectivamente, y su expresión es fundamental para dicha acción.

Pudimos amplificar el ADN copia de Pep1 de Thecaphora frezii cuya secuencia traducida codificaría para una proteína de 180 aminoácidos. Se observaron grandes homologías con ortólogas de otras especies y la presencia de cuatro cisteínas conservadas. Paralelamente, medimos los niveles de expresión de este transcripto, encontrándose muy elevado en las hifas, coincidiendo con el estadio infectivo del hongo.

Futuros estudios funcionales de inactivación génica del gen pep1 deberán realizarse para comprobar fenotípicamente el efecto que este gen provoca en cultivos de maní.

Palabras claves: Thecaphora frezii; Pep1; maní; infección Abstract

Thecaphora frezii is a phytopathogenic fungus belonging to the Ustilaginomycetes class, which causes the peanut smut disease. In its biological cycle it has three structures, teliospores (is the resistance structure), basidiospores and hyphae. The mycelium (hyphae) is the infective structure, which penetrates the plant's gynophore and initiates the infection. For this action, the expression of the Pep1 protein would be necessary since it was identified in other Ustilaginomycetes such as Ustilago maydis and Ustilago hordei, which infect corn and barley, respectively, and its expression is essential for this action.

Revista Methodo: Investigación Aplicada a las Ciencias Biológicas. Universidad Católica de Córdoba.

Jacinto Ríos 571 Bº Gral. Paz. X5004FXS. Córdoba. Argentina. Tel.: (54) 351 4517299 / Correo: 155

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Soria N W, Yang P, Díaz M S, Figueroa A C, Alasino V R, Beltramo D M . Identificación y expresión del efector central fúngico Pep1 en Thecaphora frezii.

We were able to amplify the Pep1 DNAc of Thecaphora frezii whose translated sequence would code for a 180 amino acid protein. Great homologies with orthologous of other species and the presence of four conserved cysteines were observed. In parallel, we measured the expression levels of this transcript, being higher in the hyphae, coinciding with the infective stage of the fungus.

Future functional studies of gene inactivation of the pep1 gene should be carried out to phenotypically verify the effect that this gene causes in peanut crops.

KeyWords: Thecaphora frezii; Pep1; peanut; infection.

Introducción

El maní ( Arachis hypogaea L.) es uno de los estructuras de penetración normales pero la cultivos leguminosos más importante del mundo, infección se detenía inmediatamente después de la nativo de Sudamérica, distribuido en Brasil, penetración epidérmica. Además, se encontró que Paraguay, Bolivia, Argentina y Uruguay1. De los Pep1 se localiza en el apoplasto de la planta donde 49.171

millones

de

toneladas

estimadas

se acumula particularmente en sitios de pasajes de mundialmente para la cosecha 2021, se observa célula a célula de hifas biotróficas de U. maydis9.

que China, India, Nigeria, EEUU y Argentina se Pep1 no solo es esencial para la virulencia de U.

constituyen en los cinco principales productores, maydis sino también para el hongo relacionado con con el 37%, 12%, 9%, 6% y 3% de la producción el carbón de cebada, Ustilago hordei (U. hordei), mundial respectivamente2. Durante el ciclo de que indica una función conservada de Pep1 en cultivo, el maní es atacado frecuentemente por otros biótrofos fúngicos además de U. maydis 9.

enfermedades de origen fúngico especialmente algunas que se desarrollan en el suelo durante la Objetivo

etapa de formación del fruto, durante la cosecha y en las fases de secado y almacenamiento del El objetivo de este trabajo fue comenzar a grano3,4. Uno de los causantes es el hongo identificar y caracterizar a la proteína Pep1, cuya Thecaphora frezii (T. frezii) 5.

actividad sería fundamental para la infección por El carbón del maní, enfermedad causada por T.

parte de T. frezii sobre las plantas de maní.

frezii, un hongo biótrofo, produce numerosas pérdidas anuales, teniendo mayor incidencia en la zona sur de la provincia de Córdoba. El mismo, fue Material y métodos

detectado por primera vez en la campaña 1994/95, mientras que su prevalencia, incidencia y Aislamiento y cultivo de Thecaphora frezii

severidad se ha ido incrementando en los últimos 10 años, expandiéndose, además, a otras Las teliosporas T. frezii fueron obtenidas de cajas provincias6.

de maní que presentaban síntomas de enfermedad Ustilago maydis (U. maydis) se considera un (hipertrofia) y descontaminadas superficialmente modelo fúngico importante que ha sido con etanol. Las teliosporas se desinfectaron con ampliamente utilizado en estudios biológicos y hipoclorito de sodio 5% durante 5 min y se lavaron genéticos7 y se ha considerado como un hongo de 3 veces con agua destilada estéril durante 10

gran importancia para el estudio del desarrollo minutos. Las hifas fueron obtenidas por dimórfico y de interacción planta-patógeno. La germinación de las teliosporas en medio PDA relación entre T. frezii y U. maydis, es que este (Potato Dextrose Agar). Las basidiosporas se último hongo también pertenece a la clase de obtuvieron a partir de las hifas crecidas en medio Ustilagomicetes y genera carbón en las plantas de sólido, las cuales se sembraron en agar agua (1,5

maíz.

% agar-agar). Se corroboró la formación de dichas Se acepta que la mayoría de los genes de estructuras mediante microscopía óptica.

avirulencia

fúngica

codifican

factores

de

virulencia que se llaman efectores. La mayoría de los efectores fúngicos se secretan, siendo proteínas Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc

ricas en cisteína, y ha sido demostrado un papel en El ARN total de los tres estadios de T. frezii (se la virulencia de algunos de ellos8. U. maydis combinaron tres cultivos independientes para cada expresa un efector llamado Pep1 (Protein essential etapa) se extrajo usando TRIzol (Invitrogen, EE.

during penetration 1)9. El gen pep1 está UU.)

siguiendo

las

recomendaciones

del

específicamente expresado durante el desarrollo fabricante. El ADNg se eliminó mediante del patógeno U. maydis 9. En este hongo, variantes digestión en columna con ADNasa (Qiagen) al mutantes delecionadas del gen pep1 formaban Revista Methodo: Investigación Aplicada a las Ciencias Biológicas. Universidad Católica de Córdoba. Jacinto Ríos 571 Bº Gral. Paz. X5004FXS. Córdoba. Argentina. Tel.: (54) 351 4517299 / Correo: methodo@ucc.edu.ar

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doble de la concentración recomendada por el de efectores secretados en hongos patógenos de fabricante. Se controló la posible degradación y plantas (http://effectorp.csiro.au/).

contaminación del ARN en un gel de agarosa al 1,5% (p/v) y se confirmó la pureza del ARN

Comparación de secuencias y relación

usando el espectrofotómetro NanoPhotometer filogenética

(IMPLEN, CA, EE. UU.). La concentración de ARN se midió con el kit de ensayo de ARN Qubit Las secuencias de aminoácidos completas se y el fluorómetro Qubit 2.0 (Life Technologies, CA, alinearon utilizando el programa Clustal W

EE. UU.).

(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Las La síntesis de la primera hebra de ADNc se realizó secuencias de Pep1 utilizadas para la comparación con 1 μL de Oligo-(dT)20 (50 μM) (Invitrogen), 1

fueron de las siguientes especies (número de μg de ARN total y 400 U de SuperScript III RT

acceso

de

GenBank

entre

paréntesis):

(transcriptasa inversa, Invitrogen) en un volumen Anthracocystis flocculosa (A. flocculosa) PF-1

de reacción de 20 μL incubado a 55ºC durante 1 h.

(XP_007878051.1),

U.

maydis

521

(XP_011387901.1), U. hordei (XP_041411115.1) Amplificación y secuenciamiento del

y Kalmanozyma brasiliensis (K. brasiliensis) ADNc de pep1

(XP_016292919.1). Para deducir la secuencia de Pep1 de Thecaphora thlaspeos (T. thlaspeos) fue La amplificación rápida de los extremos del ADNc necesario utilizar los programas tBLASTn 5 'y 3' (5’-RACE y 3′-RACE) se realizó utilizando (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGR

el kit comercial GeneRacer (Invitrogen) según las AM=tblastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK

indicaciones del fabricante. Las secuencias de los _LOC=blasthome)

y

http://bioinf.uni-

oligonucleótidos fueron: 5’-RACE-GSP1 5’

greifswald.de/augustus/submission.php

AYRCAVGTYTGSGGNAG 3’; 5’-RACE-GSP2

(UWYS01000010.1). El análisis filogenético fue 5’ TTGTTKKCKVDRTCGTA 3’; 5’-RACE-realizado utilizando las condiciones por defecto GSP3 5’ CYTGRDVBKYGCAGT 3’; 3’-RACE-del

software

disponible

en

GSP1 5’ TACGAYHBMGMMAACAA 3’; 3’-

http://www.phylogeny.fr/simple_phylogeny.cgi.

RACE-GSP2 5’ CTNCCSCARACBTGYRT 3’.

Después de la electroforesis de los productos de Cuantificación de los transcriptos de

PCR, se cortaron dos bandas correspondientes al tamaño esperado de aproximadamente 280 pb (5’

pep1 de acuerdo al estadio de T. frezii

-

RACE) y 260 pb (3’-RACE) del gel de agarosa y Se realizó la cuantificación de la expresión génica se purificaron usando el kit de purificación de PCR

de pep1 en los tres estadios de T. frezii a través del QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). A sistema de detección de PCR en tiempo real continuación,

los

productos

de

PCR

se

StepOne

Plus

Real-Time

PCR

system®

secuenciaron en un secuenciador de ADN

(ThermoFisher, Massachusetts, EE. UU.). Los automatizado ABI 3130XL (Applied Biosystems, oligonucleótidos se diseñaron utilizando el Foster City, CA, EE. UU.).

programa accesible en la página de GenScript®

(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-Análisis de la secuencia del ADNc de

taqman-primer-design-tool) (Tabla 1).

pep1

El ADNc se preparó a partir de las mismas muestras de ARNs utilizadas para el análisis de 5’-

La secuencia del ADNc de pep1 de T. frezii se RACE y 3’-RACE.

comparó con las de otros hongos depositados en La expresión génica relativa se realizó usando el GenBank utilizando las herramientas “BLAST-N”

transcripto de actina como gen de referencia para o “BLAST-X” disponibles en el sitio web del la normalización de la expresión. La especificidad Centro Nacional de Información Biotecnológica de los amplicones se verificó mediante el análisis (NCBI). La secuencia de aminoácidos de Pep1 de de las curvas de fusión y mediante el T. frezii se dedujo del ADNc correspondiente secuenciamiento de los fragmentos obtenidos. El utilizando la herramienta de traducción del sitio cambio de expresión en el gen pep1, en relación web

ExPASy

Proteomics

con la expresión de actina se calculó utilizando el (https://web.expasy.org/translate/). La presencia método 2-CT 10. La media y DS (±), fueron de péptido señal fue detectada usando el predictor entonces calculadas para cada una de las diferentes SignalP-5.0

Server

muestras. Los datos fueron analizados con el test (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).

La

de Student para establecer las diferencias predicción de efector fúngico en secreciones se significativas.

realizó a través del programa EffectorP, que ha sido diseñado para distinguir proteínas secretadas Revista Methodo: Investigación Aplicada a las Ciencias Biológicas. Universidad Católica de Córdoba. Jacinto Ríos 571 Bº Gral. Paz. X5004FXS. Córdoba. Argentina. Tel.: (54) 351 4517299 / Correo: methodo@ucc.edu.ar

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Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos usadas en la proteína deducida pudiera actuar como efector, la Real Time PCR

analizamos mediante el programa EffectorP, asignando una probabilidad del 0,667; 0,802; 0,555 y 0,682 de presentar esa función para T.

frezii; U. maydis; U. hordei y para T. thlaspeos, respectivamente.

Resultados

Alineamientos de secuencias Pep1 y relación filogenética

Características de la secuencia de pep1

Para estos análisis, se alinearon las secuencias de proteínas

ortólogas

de

Pep1

de

hongos

A partir del ADNc de T. frezii se logró amplificar filogenéticamente próximos a T. frezii. Para ello se un fragmento de 543 pb correspondientes a la compararon las secuencias de Pep1 de U. maydis totalidad del transcripto del gen pep1. La secuencia 521, U. hordei, K. brasiliensis, T. thlaspeos y A.

fue registrada en GenBank bajo el código flocculosa PF1 (Figura 1A y Tabla 2). Se MZ337396 y codificaría para una proteína de 180

consideró que las proteínas eran homólogas si aminoácidos, compatible con los tamaños compartían un 25% o más de identidad con una observados en otras proteínas ortólogas.

longitud de alineación mayor a 80 aminoácidos11.

Paralelamente se analizó en la secuencia proteica En la Figura 1B observamos la estructura de la predicha la posible presencia de un péptido señal a proteína Pep1 de T. frezii, con su péptido señal y través del predictor SignalP-5.0, el cual arrojó una sus 4 cisteínas conservadas.

probabilidad del 0,9062 de presencia del mismo.

Además, para evaluar la posibilidad de que la A

B

MVPRFVWPLRLLALPLVLILLLTYHPTVSSIPSRHPSTPALVRRKAPDQPPLAITMFWFNNQQKAI CYDLTARVKSVTGYTDCDFQDDYDSANNSYFLPQTCVLIAPLSEALFNILSEACRKVGTLGEMD

VKGNTPSTPITPGNPGLGGMPGTNPYAQSGNPGLGGLPGYNPGVQPSSGM

Figura 1. A: Alineamiento de secuencias de Pep1 de T. frezii, T. thlaspeos, A. flocculosa PF1, U. maydis 521, U.

hordei y K. brasiliensis. En rectángulos se señalan las cuatro cisteínas conservadas. *, identidad de secuencia en todo el conjunto de la alineación; :, una sola discrepancia en el conjunto de la alineación;., dos discrepancias en la alineación. Las secuencias subrayadas corresponden a los péptidos señales. B: Secuencia completa de la proteína Pep1 de T. frezii señalando al péptido señal (subrayado) y a las 4 cisteínas conservadas (en negritas y sombreadas).

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Tabla 2. Porcentaje de identidad y homología a nivel proteico de las distintas Pep1 de hongos fitopatogénicos (excepto A. flocculosa) respecto Thecaphora frezii Hongo

n° de aminoácidos deducidos

Identidad (%)

Homología

(%)

Thecaphora frezii

180

100

100

Anthracocystis flocculosa

161

47

63

PF1

Thecaphora thlaspeos

142

44

62

Ustilago maydis 521

178

44

65

Ustilago hordei

175

34

48

Kalmanozyma brasiliensis

181

42

61

Una posible relación evolutiva entre los hongos alineados anteriormente pudo observarse a través de la construcción de un árbol filogenético basados en las secuencias proteicas de Pep1 (Figura 2).

Figura 2. Árbol filogenético de Pep1 construido en base a T. frezii, U. maydis 521, U. hordei, K. brasiliensis, T.

thlaspeos y A. flocculosa PF1.

Análisis de la expresión de pep1

Discusión y Conclusiones

Los niveles de expresión del ARNm de pep1

Uno de los microorganismos que infecta a los fueron cuantificados mediante PCR en Tiempo cultivos del maní es el hongo T. frezii. Esta Real en los tres estadios del T. frezii, es decir, afección, llamada carbón del maní, produce teliosporas,

basidiosporas

e

hifas.

enormes pérdidas en estos cultivares.

Coincidentemente con lo esperado, los niveles del Para que muchos hongos sean fitopatogénicos es transcripto de pep1 fueron más elevados en las necesario

la

expresión

de

efectores

que

hifas y basidiosporas, respecto a lo que sucede en desencadenan el proceso infeccioso12, siendo uno teliosporas (Figura 3). Se calcularon las medias, de ellos la Pep1 (Protein essential during desviaciones standart y el valor de p mediante el penetration 1)9.

test de Student. La diferencia de expresión no fue Uno de los hongos que presenta varias significativa cuando se compararon los niveles características comunes con T. frezii es el hongo U.

presentes en las basidiosporas vs. hifas (p > 0,05), maydis, que además de ser usado como modelo de mientras que la diferencia fue significativa entre estudio de muchas características de hongos basidiosporas vs. teliosporas e hifas vs. teliosporas fitopatogénicos, causa la enfermedad del carbón (p < 0,001).

del maíz, expresa el gen pep1 9 y pertenece a la misma clase de hongos que T. frezii 13.

En este trabajo nos propusimos caracterizar al menos de manera parcial a la proteína Pep1 de T.

frezii.

A partir de la obtención del ADNc de pep1, procedimos a la secuenciación del mismo y a la deducción

de

la

secuencia

aminoacídica

correspondiente. Los análisis de esta secuencia mostraron la posible presencia de un péptido señal, el cual se encuentra presente en todos los efectores8. Además, realizando un análisis de Figura 3. Niveles de expresión del ARNm de pep1 en los tres estadios de T. frezii. La media y DS (±), fueron homología con ortólogos de Pep1 de hongos calculadas para cada una de las diferentes muestras.

próximos filogenéticamente con T. frezii, pudimos Revista Methodo: Investigación Aplicada a las Ciencias Biológicas. Universidad Católica de Córdoba. Jacinto Ríos 571 Bº Gral. Paz. X5004FXS. Córdoba. Argentina. Tel.: (54) 351 4517299 / Correo: methodo@ucc.edu.ar

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encontrar

ciertas

regiones

conservadas,

6. Cazzola, N; Gateu, M.; March, G.; Marinelli, particularmente la presencia de cuatro cisteínas A.; García, J. J.; Rago, A. y Oddino C.

que ya se ha demostrado que son esenciales para la Intensidad y pérdidas ocasionadas por carbón función Pep1 14. Esta estructura proteica también se del maní según regiones de producción.

encuentra presente en hongos que afectan a plantas XXVII Jorn Nac Maní. 2012;34–5.

monocotiledóneas como dicotiledóneas, entre 7. Bölker M. Ustilago maydis – a valuable model otros,

Sporisorium

reilianum;

Sporisorium

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expresado en estructuras del hongo como son las basidiosporas e hifas, estando estas últimas 8. Stergiopoulos I, de Wit PJGM. Fungal estructuras asociadas al estadio infectivo del Effector Proteins. Annu Rev Phytopathol hongo15.

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pueden ser el puntapié inicial para comenzar a http://www.annualreviews.org/doi/10.1146/a identificar factores que están involucrados en el nnurev.phyto.112408.132637

proceso infeccioso de T. frezii que lleva a la 9. Doehlemann G, van der Linde K, Aßmann D, enfermedad del carbón del maní y a las Schwammbach D, Hof A, Mohanty A, et al.

consecuentes pérdidas económicas.

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